痙攣型腦性癱瘓(SCP)大鼠模型【簡介】痙攣性腦癱指發(fā)育異常引起的運動和感覺功能落后,，造成肢體肌張力增高、腱反射亢進等一系列綜合征。本實驗利用腦立體定位解剖圖譜,對大鼠的錐體束部位進行精確的立體定位,通過微量注射器對大腦錐體束所在部位注射無水乙醇造成錐體束壞死,的模擬了痙攣型腦癱的解剖學及病理改變,術(shù)后大鼠產(chǎn)生明顯的屈曲痙攣癥狀,且屈肌肌張力增高,癥狀和體持續(xù)時間較長,穩(wěn)定性良好。從而建立一種可復制性良好且痙攣持續(xù)時間較長的穩(wěn)定的大鼠痙攣型腦癱動物模型,為進一步深入的探究痙攣型腦癱的基礎研究和臨床診治打下基礎【目的】痙攣型腦性癱瘓(SCP)大鼠模型建立【動物】SPF級SD大鼠，雄性,，周齡6~8W，體重：200~250g【方法】1,、大鼠麻醉,，顱頂脫毛備皮；2,、大鼠腦定位儀固定大鼠,，顱頂正中切口,，長度約2cm開口暴露前囟及矢狀縫；3,、縫線將皮膚左右分開固定,，前囟后10mm、矢狀縫左側(cè),；4,、微量注射器移至開孔處修正骨孔，注射器垂直向顱內(nèi)插入,，緩慢注射無水乙醇15ul,，注射完移除注射器，棉球壓迫止血,；5,、縫合創(chuàng)口后維持25°體溫，等待蘇醒,，觀察大鼠狀態(tài),。【觀察】術(shù)后3天模型大鼠攝食減少,、右側(cè)肢體跛行,、右前肢不負重、右前肢及右前爪屈曲痙攣明顯,。動物疾病模型是一種用于研究人類疾病的重要工具,。云南血液科研技術(shù)服務技術(shù)

RNA甲基化修飾（m6A）研究RNA甲基化修飾約占所有RNA修飾的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）是高等生物mRNA和lncRNAs上為普遍的修飾,。目前發(fā)現(xiàn)microRNA，circRNA,rRNA,tRNA和snoRNA上都有發(fā)生m6A修飾,。m6A修飾主要發(fā)生在RRACH序列中的腺嘌呤上,，其功能由“編碼器(Writer)”、“消碼器(Eraser)”和“讀碼器(Reader)”決定[1],?！熬幋a器(Writer)”即甲基轉(zhuǎn)移酶，目前已知這個復合物的成分有METTL3,，METTL14,WTAP和KIAA1429,；而ALKBH5和FTO作為去甲基酶（消碼器）可逆轉(zhuǎn)甲基化；m6A由m6A結(jié)合蛋白識別,，目前發(fā)現(xiàn)m6A結(jié)合蛋白（讀碼器）有YTH結(jié)構(gòu)域蛋白（包括YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3,，YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和HNRNPC）。m6A酶系統(tǒng)METTL3是早先被鑒定為結(jié)合SAM的組件,，其缺失引起小鼠胚胎干細胞,、Hela細胞和HepG2細胞中m6Apeaks的減少。METTL3及其同源蛋白METTL14定位在富含剪切因子的細胞核內(nèi)亞細胞器－核小斑（Nuclearspeckle）上，顯示ｍ６Ａ修飾可能和ＲＮＡ的剪切加工相關(guān),。WTAP與METTL3–METTL14二聚體相互作用,，并共定位于核小斑，影響甲基化效率,，參與mRNA剪,。而KIAA1429作為候選的甲基轉(zhuǎn)移酶復合體的新亞基。天津外包科研技術(shù)服務培養(yǎng)動物造模 | 膿毒癥造模方法之CLP造模法,。

這種細胞保持著其原始的生物學特性,，具有高度的活性和分裂能力。原代細胞在許多生物醫(yī)學研究中具有重要地位,，包括藥物篩選,、疾病模型的建立以及疫苗研發(fā)等。原代細胞的獲得通常是通過組織剪切,、消化或酶解等方式從機體或組織中分離出來,。這些細胞脫離了它們在生物體中的環(huán)境，但是仍然保持著其基本的生物學特性,，包括細胞膜,、細胞核、細胞器以及其他重要的生物分子,。原代細胞在未經(jīng)過傳代培養(yǎng)的情況下,，保持著其原始的生物學特性，因此,，它們常常被用于藥物篩選,、毒理學研究等。同時,，由于原代細胞具有高度活性和分裂能力,，它們也被用于組織工程和再生醫(yī)學中，如皮膚移植,、骨頭修復和神經(jīng)再生等,。此外，原代細胞模型在疾病研究中也扮演著重要角色,。由于原代細胞具有更高的生物真實性,，使用它們建立的疾病模型能夠更準確地模擬疾病的發(fā)展過程和藥物的作用機制，從而為新藥研發(fā)和疾病治,、療提供更有效的工具,。總之,，原代細胞是一種具有高度活性和分裂能力的細胞,，在生物醫(yī)學研究中具有重要的作用,。由于其原始的生物學特性。

1.首要原則：細胞不重要情況下立即丟棄,，培養(yǎng)箱滅菌,，所用培養(yǎng)基也都要丟棄，器械等重新滅菌或拆用新的,。2.細菌污染一般都救不回來了,，發(fā)現(xiàn)的時候培養(yǎng)基一般都很渾濁且細胞都死了3.污染且細胞很重要時：遇到念球菌污染，且細胞為基因改造細胞,，非常重要,。如231貼壁乳腺細胞，發(fā)現(xiàn)細胞周圍出現(xiàn)很小的串珠透亮圓點,，非常像念球菌污染,，此時細胞狀態(tài)尚可，且污染少,。處理如下：用預熱或室溫PBS清洗3次,，可適當振搖，將污染沖洗下來,。隨后加入10-20%雙抗到培養(yǎng)瓶,，置于37度培養(yǎng)箱1h，之后再用PBS清洗三遍,，直至視野下無可見污染,。此時細胞也被沖下大部分，因此此方法只適用在細胞貼壁強,，狀態(tài)好,，密度高時使用。之后每天再更換培養(yǎng)基,，每次用PBS沖洗2遍,。過幾天細胞狀態(tài)尚可時，消化離心時用500r,，3min，去掉上清,，重復3次,。這個方法是根據(jù)文獻可利用念球菌和細胞體積重量差異實現(xiàn)分離?；旧线@一步做完以后,，污染就基本了，接下來就注意多觀察,，勤換液就行,。常用于研究細胞的成瘤能力,、細胞的轉(zhuǎn)移、細胞的耐藥和靶分子對腫瘤細胞的發(fā)展的影響等等,。

是整體甲基化進程所必須的[2],。FTO是ALKB家族的成員，作為個被發(fā)現(xiàn)的去甲基酶,，可影響剪切因子SRSF2的RNA結(jié)合能力,，進而調(diào)控pre-mRNA的剪切加工過程[3]。目前已發(fā)現(xiàn)FTO調(diào)節(jié)異常與肥胖,、大腦畸形和生長遲緩相關(guān),，揭示m6A可能對這些疾病具有重要的調(diào)節(jié)功能[4-6]。ALKBH5是ALKB家族中被發(fā)現(xiàn)具有去甲基作用的另一個成員,，以RNaseA敏感的方式與核小斑共定位,，它可直接催化m6A-甲基化腺苷去除甲基而不同于FTO的氧化去甲基化[7].此外，ALKBH5和它的去甲基化活性影響新生mRNA合的成和剪切效率[7],，且ALKBH5敲除雄性小鼠表現(xiàn)出精子發(fā)生異常,，這可能是精子發(fā)生相關(guān)基因表達改變的結(jié)果[7]。m6AmRNA修飾執(zhí)行其功能主要通過兩個途徑：精細調(diào)控甲基化轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu),，以阻止或誘使蛋白-RNA相互作用,；或被直接由m6A結(jié)合蛋白識別，誘發(fā)續(xù)反應,。目前一類含有YTH功能結(jié)構(gòu)域的蛋白被鑒定為m6A修飾的結(jié)合蛋白,。其中YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3，YTHDC1和YTHDC2己被證實是ｍ６Ａ的結(jié)合蛋白.YTHDF1主要影響ｍ６Ａ修飾基因的翻譯,，YTHDF2主要影響ｍ６Ａ修飾基因的降解,，而YTHDC1結(jié)合ｍ６Ａ修飾的基因影響其剪接。HNRNPC是一種豐富的核RNA結(jié)合蛋白,，參與pre-mRNA的加工[8],。細胞器是細胞內(nèi)的各種功能結(jié)構(gòu)，如線粒體,、內(nèi)質(zhì)網(wǎng),、高爾基體等，它們各自承擔著不同的生理功能,。貴州科研技術(shù)服務外包

動物實驗這些取樣細節(jié),，你有注意嗎？云南血液科研技術(shù)服務技術(shù)

把膜先用TBST泡洗兩遍再用5%脫脂奶粉或者BSA室溫封閉1-2小時,。注意一定要讓蛋白面充分接觸封閉液,。2、孵一抗脫脂奶粉封閉的話,，要用TBST泡洗三遍再轉(zhuǎn)移至一抗溶液中,，BSA封閉的可以直接轉(zhuǎn)移至一抗中,。如果膜的寬(膜是一個長方形，這里的寬與長相對應)不大于8毫米,，我習慣置于15毫升離心管中孵育,，兩條膜"背對背"式放置于一個管子里(3毫升液體即可)。如果大于8毫米,，就用普通的5格的一抗孵育盒(4毫升即可),。4度過夜，一般是12-18個小時,，注意放置水平,，用搖床。內(nèi)參等蛋白豐度很高的如果孵久了可能出現(xiàn)條帶連在一起的情況,，這時可以縮短孵育時間或者降低一抗的濃度,。六、孵二抗顯影1,、孵二抗室溫一個小時足矣,。這步要注意的是建議用5%BSA或者脫脂奶粉稀釋二抗，這樣背景會干凈許多,。也要注意膜的蛋白面要充分接觸二抗溶液,，我們一般一條膜一個槽地孵。2,、顯影這一步有個細節(jié)可能有些同學沒注意到,，就是ECL發(fā)光液要與HRP反應一分鐘后顯影效果才會更好，還有要注意的是顯影液要均勻覆蓋,，一般第二次顯影(加新的顯影液)比一次好看,。云南血液科研技術(shù)服務技術(shù)